Views:0 Pengarang:Editor tapak Masa Terbitkan: 2021-11-24 Asal:Tapak
Jika ia adalah PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata untuk kuantifikasi virus dan genotaip SNP, kami memerlukan mesin PCR dengan kekhususan tertinggi yang mungkin; jika ia adalah pengesanan patogen dan mRNA, kita memerlukan sensitiviti yang tinggi mesin PCR, jadi bagaimana kita harus mengoptimumkan mesin PCR ini?
Berikut ialah senarai kandungan:
l Meningkatkan kecekapan amplifikasi mesin PCR
l Menggunakan primer mesin PCR masa nyata untuk PCR am
Untuk menambah baik mesin PCR kecekapan amplifikasi, kekhususan dan kepekaan, kami boleh mengoptimumkan mesin PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata untuk eksperimen melalui satu siri langkah. Yang pertama ialah pemilihan jujukan sasaran.
1, pilihan urutan sasaran mesin PCR masa nyata yang mudah dengan panjang yang sesuai antara 50 hingga 150bp. Urutan yang lebih pendek mengambil masa yang singkat untuk mensintesis dan mempunyai masa penguatan yang lebih pendek, jadi kemungkinan DNA yang tercemar diperkuatkan dikurangkan.
2, Apabila memilih jujukan sasaran, gunakan carian BLAST untuk menganalisis jujukan sasaran untuk polimorfisme dan ralat jujukan dan elakkannya. Sekiranya terdapat jujukan pendua dalam jujukan sasaran, ia akan mengurangkan sensitiviti pengesanan mesin PCR ini dan juga harus dielakkan.
3, mengawal kandungan GC ≤ 60% dalam urutan sasaran. Kandungan GC yang tinggi, akan menjejaskan denaturasi jujukan sasaran dalam kitaran haba, tetapi juga mudah untuk menghasilkan mesin PCR ini bukan penguatan khusus.
4, elakkan menjana struktur sekunder. Jujukan sasaran dengan jujukan berulang terbalik adalah mudah untuk menghasilkan struktur sekunder, yang menjejaskan penghibridan primer dan probe mesin PCR masa nyata yang mudah.
Di samping itu, kita juga perlu memastikan bahawa kualiti templat tidak akan menjejaskan penguatan, hasil mesin PCR masa nyata yang mudah mempunyai kebolehpercayaan. Sebagai contoh, DNA yang rosak tidak boleh dikuatkan secukupnya dalam mesin PCR, atau tidak dikuatkan sama sekali. Selain itu, kehadiran reagen perencatan polimerase DNA (DMSO, dsb.) dan bahan cemar (SDS, dsb.) dalam templat boleh menjejaskan kebolehpercayaan hasil amplifikasi mesin PCR.
Dapatkan masa nyata yang mudah mesin PCR primer, kaedah ini juga boleh digunakan untuk PCR biasa.
1, Panjangnya hendaklah 18-30bp untuk memastikan kekhususan pengikatan.
2, Suhu lebur (nilai Tm) hendaklah 55-60°C, dan nilai Tm kedua-dua primer hendaklah berbeza sebanyak 2-3°C.
3, Setiap buku asas harus mempunyai 1 hingga 3 guanine atau sitosin pada hujung 3', yang boleh mengurangkan penguatan bukan khusus semasa mesin PCR dalam masa nyata dengan mudah. Lebih daripada 3 akan menjadi bumerang dan menyebabkan "kesan gelongsor" yang membawa kepada sambungan yang salah.
4. Kandungan GC primer hendaklah sekitar 50%, kandungan GC yang terlalu tinggi akan meningkatkan nilai Tm.
5, primer mesin PCR harus mengelakkan urutan berulang terbalik, kerana ia akan membentuk struktur sekunder, menjejaskan pengikatan primer pada templat.
6, Jika RT-PCR, anda juga perlu mengelak daripada mereka bentuk primer untuk mengikat jujukan ekson, yang akan membawa kepada keputusan eksperimen mesin PCR positif palsu. Pendekatan yang betul harus direka pada rusuk intron panjang, atau intron pendek, atau merentasi kawasan simpang ekson-ekson.
7. Penyahgaraman dan pembersihan primer.
Ambil perhatian bahawa kadangkala, apabila anda telah melakukan semua mata, primer mungkin tidak membesar, jadi anda harus mereka bentuk semula primer.
Memfokuskan pada pengesanan asid nukleik pantas dan pengesanan pantas POCT, Bioteke menawarkan jenis instrumen makmal seperti: pengumpulan pensampelan virus, pengekstrak asid nukleik automatik, mesin PCR dan radas pembasmi kuman. Dan ia juga menyediakan pelbagai jenis reagen & kit.
